Nabízíme službu zaměřenou na malokapacitní produkci biomasy entomopatogenních a mykoparazitických hub. Spory hub jsme schopni produkovat jak pomocí submerzní kultivace v tekuté živné půdě, tak i produkovat spory na umělých agarizovaných živných půdách a přirozených substrátech. Pomocí technologie jsme schopni finalizovat vyprodukovanou biomasu do standardního biopreparátu určeného k aplikaci v místě výskytu živočišných škůdců popř. na lokality s výskytem fytopatogenních hub (původců onemocnění rostlin).

Integrovaná ochrana rostlin (IOR) patří ke klíčovým strategiím aplikovaného rostlinolékařství. Nabízíme službu spojenou s navrhnutím a konzultací výběru vhodné strategie IOR, tj. záměrné podpory a využívání místních přirozeně se vyskytujících druhů/kmenů mitosporických hub a cíleného využití jejich potenciálu při navození vysoké úrovně přirozené supresivity půd a střednědobé stabilizaci tohoto stavu s ohledem na podporu i dalších stabilizujících funkcí této skupiny mikroorganizmů, biologická aktivita půdy. Aktivity spočívají v záměrné podpoře či využití nativních populací organismů (v tomto případě lokálně se vyskytujících kmenů vybraných druhů mikroskopických hub na vybraných lokalitách objednavatelem), tedy populací entomopatogenních a mykoparazitických hub, které jsou přirozenou složkou v daném konkrétním agroekosystému.Realizace konceptu předpokládá jak cílené využití místních populací vybraných druhů mikroskopických hub proti konkrétním druhů živočišných škůdců či původcům onemocnění rostlin, tak i cílené zlepšení vlastností půd definovaných stavem přirozené půdní supresivity – tedy schopnosti potlačovat výskyt a rozvoj škůdců a fytopatogenních organismů.

Standardní biopreparáty na bázi entomopatogenních a mykoparazitických hub musejí splňovat řadu kvalitativních a kvantitativních kriterií a podléhají kompletnímu registračnímu procesu. Naše laboratoř je schopna hodnotit jejich kvalitu pomocí klíčových parametrů kvalitativní povahy; specifikaci podílu aktivní a doplňkové složky v biopreparátu. Stanovujeme hlavní kvantitativní parametry houbových biopreparátů jako je stanovení počtu infekčních jednotek – tzv. titr spor garantovaného producentem a distributorem, stanovení vitality spor udávané v % a zároveň jsme schopni hodnotit i vitalitu pomocí testu GI, kdy se každé spoře přiřadí index fáze klíčení. Poslední kvantitativní parametr, který testujeme je počet kolonie tvořících jednotek (CFU – colony forming units). CFU udává kolik jednotek patogena přítomných v 1 g nebo 1 ml biopreparátu utvoří samostatnou kolonii na umělé živné půdě.

Nabízíme službu dlouhodobého ukládání a uchovávání matečných kultur kmenů vláknitých hub za použití techniky imobilizace biomasy kmenů do alginátových pelet. Alginátové pelety ukládáme do mrazicího boxu při teplotě přibližně -20°C. Uložené kmeny v alginátových peletách jsme schopni aktivovat a jako čistou kulturu zaslat na agarových plotnách. Sbírka entomopatogenních a mykoparazitických hub není oficiální sbírkou, slouží momentálně pro interní potřebu.

Identifikace na úrovni druhu představuje mandatorní předpoklad cíleného využívání entomopatogenních a mykoparazitických hub. Identifikace partikulárních kmenů jednotlivých druhů entomopatogenních a mykoparazitických hub představuje velmi složitý problém, jehož obecné řešení spočívá v oblasti aplikace specifických determinačních technik a metod (např. fenotypové a fyziologické markery). Nicméně, z hlediska praktického využití jsou nezbytné základní charakteristiky kmenů, zejména pak kmenově specifické parametrizace rychlosti vývoje (růst středových kultur), produkce spor (množství spor/1 mm2 kultury, resp. spor/1 g přirozeného substrátu), vitalita spor (klíčivost - %) a virulence (účinnost kmene stanovená pomocí standardního laboratorního biotestu). Nabízíme službu polyfaktoriálního hodnotícího systému umožňujícího definovat možnosti následného praktického využití jednotlivých kmenů v kontextu základního cíle – využití lokálních kmenů entomopatogenních a mykoparazitických hub při záměrném navýšení přirozené supresivity zemědělsky využívaných půd.

Entomopatogenní a mykoparazitické mikroskopické houby představuji velmi významnou obligátní složku půdní mikroflory. Funkční (trofický) statut uvedené skupiny hub je však podstatně širší, protože kromě parazitické vazby na řadu hmyzích škůdců (entomopatogenní houby) nebo původců houbových onemocnění rostlin (mykoparazitické houby), zaujímají v ekosystémech i klíčovou úlohu organizmů podílejících se na rozkladných procesech (saprotrofní organizmy). Nabízíme službu izolace a diagnostiky přítomnosti entomopatogenních a mykoparazitických mikroskopických hub v půdách a fyloplánu. Metody izolace jsou založeny na precizních laboratorních postupech využívajících selektivní techniky (selektivní umělé živné půdy, resp. metody tzv. „živých pastí“). Pomocí těchto metod lze v jakémkoliv půdním vzorku, resp. vzorku odebraném z nadzemních částí rostlin detekovat přítomnost vybraných druhů entomopatogenních nebo mykoparazitických hub a současně stanovit frekvenci jejich výskytu (= počet vitálních jednotek na 1g půdy, resp. rostlinné biomasy).

(Entomopatogenní houby – mikroskopické houby schopné vyvolávat primární onemocnění na hmyzích hostitelích; Mykoparazitické houby – schopné parazitace na jiných druzích mikroskopických (fytopatogenních hub, způsobující choroby rostlin).

Proces zahrnuje detekci konstruktu nesoucího gen pro fúzní protein (spi2 + GFP) v rostlinách tabáku, hodnocení exprese pomocí RT-PCR, izolaci exprimovaného proteinu a jeho kvantifikaci.

U transgenních rostlin tabáku, generace T2 bude vyvinut postup pro ověření přítomnosti transgenu na základě PCR detekce a dot-blot hybridizace (izolace genomické DNA, PCR se specifickými primery nebo dot-blot hybridizace s přímo značenou sondou získanou z plasmidu nesoucího cílový konstrukt). Pro hodnocení exprese bude vyvinut postup izolace mRNA a kvantifikace exprese – resp. úrovně transkripce pomocí RT-PCR. Postup rovněž zahrnuje izolaci exprimovaného proteinu, jeho identifikaci a kvantifikaci, hodnocení enzymové aktivity a hodnocení antimikrobiálních účinků fúzního proteinu (v in vitro a in vivo podmínkách).

Molekulární selekční markery mohou zásadním způsobem ovlivnit rychlost a úspěšnost šlechtitelského procesu a získání nových odrůd. Předpokladem pro úspěšný vývoj markeru je dostupnost kontrastních rodičovských linií a segregujících generacích pro sledovaný znak. Vývoj markeru pak spočívá v izolaci DNA, PCR analýze a identifikaci diskriminantních markerů, odvození specifických primerů a ověření stability a síly markeru na segregujících populacích.

Kultivace submerzních a povrchových kultur v řízených podmínkách (kapacita submerzní kultivace 40x100ml, 20x250 ml, 4x2000ml, kapacita povrchové kultivace – xset Petriček). Uchovávání matečných kultur v hlubokomrazicím boxu v v glycerinu nebo uchovávání kultur po lyofilizaci.

Metodický postup zahrnuje postupy izolace DNA z rostlinného materiálu a metody detekce a kvantifikace přítomnosti záměrně vnesené cizorodé DNA – transgenu. DNA je izolována dle příslušného protokolu z čerstvého materiálu (odebraného v laboratoři nebo v polních podmínkách a uchovávaného do doby izolace na ledu po dobu 2–4 hod) nebo z materiálu zamraženého (po odebrání materiál zamrazíme v tekutém dusíku a uchováváme při teplotě -80°C) či lyofilizovaného materiálu (vzorek zamrazíme při -80°C a následně lyofilizujeme, po lyofilizaci homogenizujeme a získaný prášek uchováváme při teplotě -20°C).

Detekce GMO je založena na multiplex PCR s použitím dvou sad primerů (amplifikaci úseku transgenu a amplifikace „interního standardu“ – vlastního rostlinného genu). Navržený metodický postup umožňuje specifickou detekci přítomnosti transgenu v DNA obsažené rostlinách a rostlinném materiálu, při multiplexové PCR získány 2 produkty – amplifikovaný úsek odpovídající detekovanému transgenu GNA a amplifikovaný úsek genu UDP signalizující „správný“ průběh PCR reakce. U netransgenní kontroly je pak získán pouze úsek odpovídající rostlinnému genu. Detekční limit reakce je 10% kontaminace transgenu (2,5 ng DNA transgenního organismu) ve vzorku.

Kvantifikace GMO je založena qRT-PCR postupu - analýza probíhá jako dvě uniplexové PCR reakce na jednom přístroji během jednoho experimentu. Primerové páry byly navrženy pro amplifikaci úseku transgenu a druhý primerový pár je navržen jako „interní standard“ pro amplifikaci úseku rostlinného genu. Analýza probíhá na přístroji MiniOpticon (BioRad) a detekční limit = 0,01% a kvantifikační limit = 0,05%.